叶酸在人体细胞生长中扮演着重要的角色，同时也是每个孕产妇的“老朋友”。研究表明，孕前3个月每天补充0.4 mg叶酸，可使子代神经管畸形的发生减少50%~70%。
先天性心脏病(CHD)是最常见的出生缺陷，在我国活产新生儿中的发病率约为8.98‰，是婴幼儿和5岁以下儿童死亡的主要原因之一。但叶酸对先天性心脏病(CHD)是否具有同样的保护作用一直存在广泛争议。
2024年10月10日，南方医科大学附属广东省人民医院心脏外科陈寄梅教授和全球卫生研究中心李杰教授领衔，在医学顶级期刊JAMA子刊《JAMA Nnework Open》（医学一区top，IF=10.5）发表了一篇题为：“Maternal Serum Folate During Pregnancy and Congenital Heart Disease in Offspring”的研究论文，旨在探讨妊娠早中期母体血清叶酸水平与子代CHD风险之间的剂量-反应关系，以及母体血清叶酸、维生素B12和同型半胱氨酸水平与子代CHD风险之间的联合关联。
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研究设计类型—巢式病例对照研究
小科普
何为巢式病例对照研究？
巢式病例对照研究(nested case control study,NCCS)，也称队列内病例对照研究(case control study within a cohort)，是一种将病例对照研究和队列研究进行组合后形成的一种新的研究方法。
即在一个事先确定好的队列进行随访观察的基础上，再应用病例对照研究的设计进行研究分析的一种设计思路。
巢式病例对照研究又有以下分类：
步骤如下：
一般情况下，随访结束后，研究者会将新发的病例全部挑选出来，作为病例组。然后按照1:1或1:n的比例，以病例进入队列的时间、疾病出现的时间以及年龄、性别等信息作为匹配条件进行匹配，再从同一队列中随机抽取未发生疾病的研究对象作为对照组。
在本文中，研究团队使用广东省人民医院孕产妇出生队列2015年至2018年的数据，并按照1:4的匹配原则，对于每个先天性心脏病病例，研究者选择了4个与母亲怀孕年龄相匹配的对照。排除单纯性卵圆孔未闭、动脉导管未闭的早产儿、非单胎妊娠以及伴有染色体异常、基因突变或心外畸形的先天性心脏病病例。
最终纳入了129例先天性心脏病患者和516例匹配的非先天性心脏病对照。
该项研究中同样存在数据缺失，对于46名（7%）没有足够DNA样本进行基因分型的参与者，研究团队使用野生型基因型填补缺失值。
条件logistic回归评估暴露与结局的关联
研究团队将母体叶酸水平分为低、中、高三层，并以中叶酸水平为参照组，采用条件logistic回归分析母体血清叶酸低水平和高水平与子代CHD发生风险的关联，在多变量模型中调整了协变量。
并在条件logistic回归采用设定了3个节点的限制性立方样条分析母体血清叶酸水平与子代CHD风险之间的非线性关联，并对模型3中的变量进行调整，采用似然比检验估计非线性P值。
研究结果表明，母体血清叶酸水平与子代CHD风险之间存在u型关联。
与叶酸中等水平相比，最低四分位数(OR：3.09)和最高四分位数(OR：1.81)与子代CHD发病风险增加相关；
与WHO标准定义的正常叶酸水平相比，叶酸缺乏和升高与子代CHD发病风险增加相关。
模型1：未调整；
模型2：调整了围受孕期叶酸补充、母亲教育、职业、产次、流产史、妊娠合并糖尿病、妊娠合并高血压、妊娠合并心脏病、感染和体外受精和胚胎移植；
模型3：在模型2上另外调整了母亲MTHFR 677、MTHFR 1298和MTRR 66多态性。
为确保结果的稳健性，研究团队进行了敏感性分析。
在排除了46名因DNA样本不足而无法进行基因分型的参与者，再次进行条件logistic回归，研究结果与先前一致。
交互作用分析
为了研究母体血清叶酸水平与子代冠心病风险的关系是否受到母体维生素B12缺乏和同型半胱氨酸升高的影响，我们在模型3中进一步调整了母体血清维生素B12和同型半胱氨酸水平，并在乘法尺度上检验了它们的交互作用。
研究结果表明，低和高母体叶酸与CHD风险之间的不利关联，可能因维生素B12缺乏或同型半胱氨酸升高而进一步放大。
具体而言，研究团队发现母体血清维生素B12水平与子代CHD风险呈L型关联，这意味着母体维生素B12缺乏与子代CHD风险增加相关。
同时，母体血清同型半胱氨酸水平与子代CHD风险之间呈倒L型关联，意味母体同型半胱氨酸升高与子代CHD风险增加相关。
中介作用分析
考虑到叶酸和维生素B12缺乏可导致同型半胱氨酸水平升高的机制，研究团队根据Baron和Kenny提出的方法进行了中介分析，以评估高同型半胱氨酸在低叶酸和维生素B12缺乏与CHD风险之间关联的中介效应。
结果显示，同型半胱氨酸升高占低叶酸水平与CHD风险关联的32.9%。
闲来郑语
这篇文章研究设计和方法考虑都比较全面，除了主要的分析外，还额外分析了维生素b12和同型半胱氨酸，考虑了血清叶酸浓度、基因型和叶酸服用情况，同时分析交互作用和中介效应，值得我们一起学习。
并且，文章中，研究者还分享了分析主要用到的R包，survival、rcssci、interactionR和mediation包，诸位不妨研究研究。同时，本研究为过度的叶酸补充敲响了警钟。过犹不及，适量最好。
在真实世界临床研究中，队列研究是最常见的设计方法，病例对照研究由于其一定的缺陷并不多见，但是两者的结合--巢式病例对照研究也较为常见。
相较于传统的病例对照研究，巢式病例对照研究中的病例和对照组对象都是从同一个队列中选取出来的，具有可比性，可以较好的控制选择偏倚。
更重要的是，巢式病例对照研究中时间顺序是由过去到现在，因果推断的时间顺序明确，可以更好的控制回忆偏倚。
并且，相较于传统的队列研究，巢式病例对照研究无需对队列内所有成员进行生物标本的检测，因此比队列研究更省时省力并且还可以用于罕见病的研究。
巢式病例对照研究分析套路不止一种，也不乏登上医学顶刊的文章，感兴趣的不妨看看先前的文章:
中国学者历经24年，发文医学顶刊NEJM！这项巢式病例对照研究如何分析的？
希望今天的分享对大家有点帮助。
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